El control de calidad del ADN es un aspecto crucial en la aplicación del programa BIOMED-2, principalmente a muestras incluidas en parafina. Se aconseja el desarrollo de una PCR para amplificar genes control con 5 pares de cebadores que permiten amplificar fragmentos de 100, 200, 300, 400 y 600 pb de longitud, lo cual nos orientará sobre la calidad del ADN de la muestra analizada. Todos los fragmentos de PCR del proyecto BIOMED-2 miden menos de 600 pb (fig. 3). Se recomienda realizar la PCR con 2 cantidades de ADN para excluir el efecto de inhibidores de la PCR (tabla 1)15.

Figura 3.

PCR de control de calidad del ADN. Control de calidad del ADN obtenido de muestras frescas/congeladas y en parafina. La banda de mayor tamaño indica el tamaño máximo amplificable mediante PCR de un segmento de ADN.

(0,09MB).

El material fresco o congelado es el mejor tipo de muestra para obtener ADN de calidad, sin embargo, la mayor parte de las muestras estudiadas en la rutina diagnóstica suelen corresponder a material fijado en formol y parafinado. El ADN obtenido de estas muestras suele ser de mala calidad, sobre todo si la biopsia fue archivada durante más de 2 años. El proceso de fijación seguido y la calidad del tejido estudiado son asimismo factores determinantes20. Por ello, resulta fundamental realizar un control de calidad del ADN previo a la amplificación. Si el ADN obtenido no supera en el control de calidad una longitud en pb superior al tamaño del gen o segmento amplificado, los resultados obtenidos no suelen ser valorables. Se aconseja asimismo la práctica de un control histológico simultáneo a la obtención del tejido para la extracción del ADN para corroborar que la muestra estudiada es representativa.

Recientemente, se han descrito sistemas automatizados de lectura de los fragmentos de PCR amplificados que permiten aumentar la capacidad de discriminación con respecto a los sistemas clásicos de lectura en geles de electroforesis21-28. El proyecto BIOMED-2 recomienda la lectura de los productos amplificados de PCR mediante electroforesis capilar utilizando cebadores marcados con fluorocromos (GeneScan [GS]) o utilizando geles de poliacrilamida en los que se analiza la formación de heterodúplex (análisis heterodúplex [AH])29-31.

En una neoplasia linfoide, al proceder todas las células de un clon maligno éstas presentarán el ADN reordenado de la misma forma, por lo que al estudiar mediante PCR el reordenamiento VDJ se obtendrá uno o 2 productos de PCR (reordenamiento de uno o 2 alelos). Por el contrario, si el ADN procede de una población policlonal existirán numerosos reordenamientos VDJ. La visualización del producto de PCR se puede realizar mediante electroforesis en geles de acrilamida o electroforesis capilar. En el primer caso observaremos múltiples bandas discretas si se trata de una población policlonal o una o dos bandas si se trata de una población monoclonal. Mediante electroforesis capilar observaremos múltiples picos con una distribución gaussiana de pesos moleculares en el caso de poblaciones policlonales y uno o dos picos en las poblaciones monoclonales.

El AH utiliza productos de PCR de doble cadena y los separa en función de su longitud y conformación, mientras que GS analiza productos de una sola cadena y los separa únicamente en función de su longitud. En el caso de una muestra con una población linfoide monoclonal se formará una proporción variable de homodúplex. Su visualización mediante electroforesis en gel de poliacrilamida permite ver una banda de una longitud adecuada. Las muestras con una elevada proporción de células policlonales producen elevada cantidad de heterodúplex con poca probabilidad de unión de homodúplex.

El GS permite distinguir entre los productos amplificados incluso cuando difieren en un solo pb de longitud, permitiendo detectar un mismo clon en diferentes muestras o tejidos sin necesidad de realizar una secuenciación. Se considera que el sistema AH podría mostrar una sensibilidad y especificidad superiores al GS, especialmente en las amplificaciones de los reordenamientos de IgK, Kde e Igγ. En el análisis de los segmentos DJ del gen IgH pueden usarse indistintamente AH o GS15.

Análisis de fragmentos fluorescentes (GeneScan)

En el sistema GS uno de los cebadores es marcado con fluorocromo y después de la amplificación los productos de PCR se discriminan o se separan en sistema de electroforesis en capilares de polímeros. Para dicho proceso, un microlitro del producto de PCR se mezcla con 0,5μl de un producto de peso molecular estándar (GeneScan 400-ROX, Applied Biosystems, Foster City, CA) en 9μl de formamida desionizada (Applied Biosystems) para su separación por desnaturalización en cadenas simples de ADN. Los productos son detectados de forma automática por lectura de fluorescencia mediante un sistema láser en un secuenciador automático de ADN (ABIPrism 3100, Applied Biosystems). Un resultado se considera monoclonal si se obtienen uno o 2 picos de producto amplificado con una longitud en pb apropiada para la técnica de PCR que se está analizando. Si se detectan de 3 a 5 picos puede considerarse como un resultado oligoclonal y más de 5 picos de longitudes diferentes como un resultado policlonal. Para considerar un resultado como un patrón monoclonal verdadero, la altura de un pico debe ser de al menos el doble de la distribución normal de los picos policlonales, correspondientes a las células reactivas acompañantes del infiltrado (fig. 4).

Figura 4.

Sistema automatizado de lectura de fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa, GeneScan. En la figura se muestra un resultado monoclonal mediante el análisis de FRII y FRI en un caso policlonal en el estudio FRIII.

(0,18MB).

La sensibilidad global en la detección de clonalidad linfoide B o T de los protocolos BIOMED-2 y lectura mediante GS es de aproximadamente 0,5-5%. Los límites de la sensiblidad dependen de la técnica empleada, de la calidad de la muestra (las muestras parafinadas tienen menor rendimiento) y de la proporción de la población linfoide reactiva acompañante. Una técnica se considera suficientemente sensible si detecta al menos una población clonal que suponga el 5-10 % de la población linfoide total del infiltrado.

Análisis de heterodúplex

Los productos de PCR se desnaturalizan por calor (95°C durante 5 minutos) y posteriormente se renaturalizan rápidamente a temperatura baja (4°C durante 1 hora) para buscar de nuevo su hibridación espontánea, ahora de forma aleatoria, de tal modo que se obtienen fragmentos de ADN homo- o heterodúplex con diferente conformación. Las diferentes conformaciones obtenidas dan distintas características físicas a los heterodúplex, lo que permite separarlos mediante electroforesis en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. Los homodúplex logran una hibridación perfecta y emigran de forma más rápida. Los productos de PCR correspondientes a muestras monoclonales forman una elevada proporción de homodúplex mezclados con heterodúplex obtenidos de los linfocitos policlonales o reactivos acompañantes y se separan claramente en el gel de poliacrilamida en forma de una banda. Las muestras policlonales producen únicamente heterodúplex (fig. 5).

Figura 5.

Análisis heterodúplex. El AH puede ser más informativo que el GS en determinados reordenamientos como en el caso de Igλ representado en la figura.

(0,18MB).

La técnica de AH es rápida y sencilla y posee una sensibilidad global en la detección de clonalidad linfoide B o T (aplicando los protocolos BIOMED-2) de aproximadamente el 1-10 %, incluso cuando se estudian biopsias de archivo incluidas en parafina.

La amplificación del gen VJ de la subunidad TCRγ mediante PCR es el método más empleado en la evaluación de la clonalidad de un infiltrado cuando se sospecha un origen de estirpe celular T4,8,10-12,23,26,29,30,34,35. Es una técnica relativamente simple, ya que el gen se reordena empleando un repertorio limitado de segmentos genéticos. La longitud del segmento amplificado (aproximadamente de unos 200 pb) permite la obtención de resultados en la mayor parte de muestras de material de archivo. El gen TCRγ se encuentra reordenado en la mayor parte de las células T tanto si expresan en superficie el TCRαβ como el TCR78.15,36,37

El análisis de PCR del gen completo VDJ o incompleto DJ que codifica la subunidad TCRβ es una técnica de mayor complejidad9,38,39. La subunidad TCRβ posee un mayor número de segmentos potencialmente reordenables, por lo que obliga a utilizar un mayor número de cebadores, siendo los segmentos amplificables de mucha mayor longitud o tamaño (fig. 6). El gen TCRβ se encuentra reordenado no sólo en todas las células TCRαβ, sino también en muchas TCRγδ15,36,37. El análisis de PCR del gen TCRβ representa un estudio complementario a realizar cuando exista una sospecha razonable de linfoma de células T con resultados de PCR-TCRγ no concluyentes. La combinación de ambos estudios puede permitir la detección de clonalidad T en prácticamente el 100 % de las muestras de linfomas de células T15.

Figura 6.

Reordenamiento del gen TCRβ. La figura muestra un resultado clonal TCRβ no detectado por TCRγ

(0,13MB).

Pueden detectarse asimismo los reordenamientos del gen TCRδ y pueden ser de utilidad tanto en el estudio de neoplasias de células linfoides inmaduras como en los procesos linfoproliferativos derivados de células TCRγδ36,37. Como consecuencia de su complejidad (con un elevado número de segmentos posibles a combinar y muy separados entre sí en su distribución en el genoma), el gen TCRα no se incluye en el proyecto BIOMED-215.

La mayor parte de los trabajos publicados empleando sistemas de lectura de geles de electroforesis muestran tasas de clonalidad en linfomas cutáneos de células T (LCCT) en un rango variable del 40-90 % de las muestras35. Diferentes aspectos técnicos, tipo de sistema de lectura de los productos amplificados, características de las muestras (parafinadas o congeladas, proporción variable entre estadios precoces o avanzados) pueden explicar las diferencias en las distintas series. Suele detectarse con mayor frecuencia una proliferación linfoide T monoclonal en los casos de micosis fungoide (MF) en estadios avanzados y de síndrome de Sézary (SS) (90-100 %) en relación con lesiones de MF en fases precoces (50-70 %)8,2,23,26,29,30,34,35,38-42.

La aplicación de técnicas de PCR y sistemas de lectura de elevada sensibilidad y especificidad (GS, AH) permiten detectar monoclonalidad linfoide en torno al 60–70 % de las muestras de LCCT8,12,23,26,29,30,40-42. En la serie de

Ponti et al 162/194 (83,4 %) muestras de LCCT resultaron clonales mediante PCR para la amplificación del TCRγ y análisis mediante AH35. Resultados similares (84 %) fueron obtenidos por los mismos autores empleando el sistema GS34. Parece existir una buena correlación entre las características del infiltrado (densidad, epidermotropismo), inmunofenotipo (pérdida de antígenos de células T) y estadio con la detección de la presencia de un clon dominante. Excepcionalmente, Cherny et al41 sólo detectaron un 42 % de muestras clonales mediante AH en una serie de LCCT, sin embargo, este resultado parece poco representativo debido al reducido número de casos analizados (n=7).

La aplicación de los protocolos BIOMED-2 y análisis por GS ha demostrado tener una alta sensibilidad en el estudio de distintos procesos linfoproliferativos cutáneos de células T. Aunque faltan resultados sobre series amplias de muestras en parafina, se han detectado clones T en un 63–85 % de muestras cutáneas de MF/SS mediante PCRGS del TCRγ y en un 63–75 % mediante PCR-GS del TCRβ38,42.

La detección de un clon dominante en los procesos linfoproliferativos CD30+ es sensiblemente menor que en el resto de LCCT, quizás en parte debido a las características peculiares de un infiltrado linfomatoso que suelen tener una celularidad variada43-45. En nuestra experiencia, la mitad de las muestras de papulosis linfomatoide (PL) de material congelado suelen ser clonales, así como las dos terceras partes de los LCCT CD30+. En un trabajo reciente realizado sobre muestras parafinadas de PL y LCCT CD30+ mediante PCR-GS sólo se detectó un clon T en un 22 % de los casos (4/18) de PL, particularmente en aquellas formas con un porcentaje elevado de células atípicas. En dicho trabajo en las muestras de LCCT CD30+ la tasa de detección alcanza el 65 % de los casos46.

Estos resultados indican que la demostración de un clon dominante es una característica importante en el diagnóstico de un LCCT, siendo infrecuente la presencia de un patrón de reordenamiento policlonal. Sin embargo, también se ha detectado la presencia de un clon linfoide T en un número variable de casos de dermatosis inflamatorias crónicas consideradas benignas y con una relación incierta respecto del desarrollo de un verdadero LCCT39,47,48. Algunos autores han propuesto el concepto de«discrasias linfoides cutáneas»para designar a este grupo de procesos, que incluirían la pitiriasis liquenoide, algunos casos de dermatosis purpúricas pigmentadas, paniculitis lobulillares atípicas, ciertas reacciones a fármacos o incluso un grupo de entidades incluidas bajo el concepto de«parapsoriasis»(PP)49.

El diagnóstico diferencial entre las lesiones de PP, definidas como placas eritemato-descamativas persistentes sin criterios histopatológicos diagnósticos de MF, con respecto de las lesiones precoces de MF puede plantear importantes dificultades prácticas. Existe una cierta controversia con respecto a la tasa de detección de clonalidad T en estos casos. Algunos autores detectan clonalidad linfoide T en casi un 50 % de las muestras, proponiendo que estos casos deben considerarse bien como lesiones pre-MF, bien como verdaderas MF incipientes. Sin embargo, otros autores no detectan clonalidad en prácticamente ningún caso50-54. Probablemente la razón de estas discrepancias se deba a la falta de unos criterios homogéneos empleados en la definición del concepto de PP (tabla 2)55. En nuestra experiencia, con la aplicación de PCR para el TCRγ la tasa de detección de clonalidad en lesiones de PP es muy baja, menor del 5 %, mientras que aproximadamente el 70 % de los casos de MF en estadios precoces son clonales56.

Finalmente, el análisis mediante GS permite la evaluación de la concordancia clonal entre muestras de distintos procesos linfoides que acontecen de forma simultánea o sucesiva en un mismo paciente (por ejemplo, lesiones de MF y de PL). En el caso de que se trate de un mismo clon, el pico monoclonal debe ser idéntico, de la misma longitud, pudiéndose evitar la realización de una secuenciación de los productos de PCR57,58.

Los datos publicados en la literatura referentes a la detección de un clon dominante en procesos linfoproliferativos reactivos T es muy variable (0–24 %)59-61, tratándose en general de trabajos que emplean sistemas clásicos de electroforesis. Ponti et al demostraron la existencia de un clon dominante hasta en un 2 % de muestras de una serie extensa de lesiones reactivas T, indicando una buena especificidad del AH (97,7%), siendo particularmente útil en la distinción entre eritrodermias de origen inflamatorio y SS35. La especificidad de los protocolos BIOMED-2 en el análisis de muestras cutáneas de origen o carácter reactivo es elevada42. En este sentido, ante la necesidad de confirmar la presencia de un clon T en un infiltrado linfoide reactivo, el estudio del gen TCRβ, por su mayor repertorio genético, quizá ofrezca una mayor especificidad39.

El estudio del reordenamiento del gen IgH se realiza mediante cebadores consensuados para las regiones FRI, FRII o FRIII del segmento VH y para el segmento JH. El estudio del segmento FRIII-JH es el más habitualmente realizado por razones de índole técnica, ya que el número de genes combinables es menor y ambos segmentos están muy próximos en el gen reordenado (aproximadamente 100 pb).

Dentro de un contexto clínico-patológico adecuado, en casos en los que no se detecta clonalidad linfoide B tras la amplificación por PCR del segmento FRIII-JH, se recomienda el estudio de los segmentos FRII y el FRI. Sin embargo, el segmento FRI tiene una longitud considerable y su estudio requiere muchos más cebadores, por lo que pocas veces es factible realizarlo a partir de muestras incluidas en parafina15.

En los protocolos BIOMED-2 se incluye no sólo el análisis del gen completo VDJ del gen IgH, sino también el diseño de una PCR para el estudio del reordenamiento incompleto DJ15. Este segmento se ve afectado con menor frecuencia por el proceso de hipermutaciones somáticas, fenómeno muy habitual en las neoplasias maduras de células B19. El elevado número de hipermutaciones somáticas, que ocurren en los segmentos VH durante el tránsito de la célula B por el centro germinal, condiciona una mayor probabilidad de fallo en la hibridación del primer y, por tanto, de resultados falsamente negativos.

Por otro lado, se describen las PCR para la amplificación de los genes Igλ e IgK que en determinadas circunstancias pueden permitir aumentar la sensibilidad en la detección de clonalidad B62. Además, no sólo puede realizarse el estudio del gen completo IgK, sino también la detección del reordenamiento del segmento Kde, tampoco afectado por hipermutaciones somáticas. El reordenamiento del Kde suele estar presente en todas las neoplasias Igλ y una tercera parte de las de origen IgK. El estudio de los reordenamientos incompletos DJ, así como de los genes Igλ e IgK y del Kde, se emplea en aquellos casos en los que no se ha podido demostrar la presencia de una población monoclonal B después del análisis del gen completo (VDJ) IgH (fig. 7)15.

Figura 7.

Estudio del reordenamiento incompleto DJ del gen IgH. Caso clonal por DJ (B) no detectado en el estudio del gen completo VDJ (A).

(0,15MB).

El estudio de la clonalidad linfoide B mediante PCR de la región FRIII permite detectar clonalidad en un 30–70 % de los linfomas B dependiendo del tipo de muestra y técnica de laboratorio empleada1,27,63,64. La aplicación del protocolo BIOMED-2 en muestras de linfomas sistémicos de células B de calidad adecuada estudiando simultáneamente las regiones FRI, FRII y FRIII podría detectar un patrón clonal hasta en un 90–95 % de los casos. La razón por la cual no se detecta clonalidad en la totalidad de casos es, muy probablemente, la presencia de hipermutaciones somáticas15,16.

La combinación del estudio del reordenamiento completo de la IgH (VDJ) con el de los reordenamientos incompletos DJ, así como el reordenamiento de las cadenas ligeras, ha permitido alcanzar un porcentaje de detección de clonalidad en prácticamente el 100 % de los casos de los linfomas del manto, leucemias linfáticas crónicas, linfomas foliculares y los linfomas de la zona marginal, y hasta el 98 % de los linfomas difusos de células B grandes15,16.

En los linfomas cutáneos de células B (LCCB) los diferentes trabajos publicados que emplean técnicas de PCR sobre clonalidad B, y en general con sistemas de lectura en electroforesis, detectan una sensibilidad entre el 34–83 %42,63,65-70. Se ha de tener en cuenta que en la mayor parte de los trabajos publicados se analiza exclusivamente la región o segmento FRIII, por lo que los resultados falsos negativos pueden representar hasta el 50 %64.

Gellrich et al, en un trabajo reciente sobre muestras en parafina de LCCB y empleando los protocolos BIOMED-2 para la amplificación del gen completo VDJ IgH (FRIII, FRII, FRI), demostraron una tasa de clonalidad global del 55,8 % (el 100 % en los LCCB tipo de las piernas, el 54,5 % en los LCCB de la zona marginal y el 66,7 % en los LCCB foliculares)71. En este trabajo la PCR para FRIII detectó un 46,5 % de clonalidad (el 100 % en los tipo de las piernas, el 36,4 % en los linfomas de la zona marginal y el 40,7 % de los linfomas cutáneos foliculares). La PCR de FRI detectó sólo un 20,9 % considerando todas las muestras (hasta un 76 % de las muestras en parafina tenían un control de calidad inferior al aconsejable para amplificar el fragmento FRI). Sin embargo, si se consideraban sólo las muestras amplificables, la PCR de FRI mostraba la tasa de detección de clonalidad más alta (90 %), lo cual indica que es una excelente técnica, particularmente en material fresco o congelado. El estudio de otras regiones FR parece aumentar de forma significativa la sensibilidad y, probablemente aún más de forma muy considerable si se añaden asimismo en el análisis genotípico B los reordenamientos incompletos DJ, Igλ, IgK y Kde15.